1  诱惑红的测定

1.1  原理：样品经溶解、稀释、过滤后，使用具有紫外检测器的高效液相色谱仪测定诱惑红，根据色谱峰的保留时间定性，外标法峰面积定量。

1.2  试剂

1.2.1  甲醇：色谱纯

1.2.2  聚酰胺粉：过100目筛

1.2.3  乙酸铵溶液（0.02moL/L）：称取1.54g乙酸铵加水至1000mL，溶解，经0.45μm滤膜过滤。

1.2.4  甲醇-甲酸（6+4）溶液：量取甲醇60mL、甲酸40mL，混匀。

1.2.5  无水乙醇-氨水-水（7+2+1）溶液：量取无水乙醇70mL、氨水20mL、水10mL，混匀。

1.2.6  柠檬酸溶液：称取20g柠檬酸，加水至100mL，混匀。

1.2.7  pH6的水：水加柠檬酸溶液调pH值至6。

1.2.8  诱惑红的标准溶液的：准确称取0.1g诱惑红的标准品于100.0mL容量瓶中，用纯水溶解、定容，配成1.00mg/mL储备液，备用。临用前用水稀释成所需使用液。

1.3  仪器：高效液相色谱仪（附紫外检测器）

1.4  色谱条件

1.4.1  色谱柱：150×4.6mm，5μm ODS C18柱。

1.4.2  流动相：甲醇-乙酸氨溶液（0.02 moL/L）=35:65，梯度洗脱，甲醇：20～35%，3%/min；35～98%，9%/min；98%继续6min。

1.4.3  检测波长：254nm

1.4.4  柱温：室温

1.4.5  流速：1mL/min

1.5  样品处理：精密称取约3g，放入100mL烧杯中，加水30mL，置60℃水浴使其完全溶解。

1.6  色素提取：样品溶液加柠檬酸溶液调pH值至6，加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入试样溶液中，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽滤，用60℃的水（pH4.0）洗涤3～5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗涤3～5次，再用水洗至中性，用无水乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解并定容至5mL，经0.45μm滤膜过滤，取10μL进高效液相色谱仪。

1.7  样品测定：分别取1μL标准液及试样处理液注入色谱仪中，以保留时间定性峰面积定量。

1.8  结果计算

                  A₁×C×V

X = ——————

A₂×M

式中：

X—样品中诱惑红的含量，mg/kg；

A₁—样品的峰面积；

A₂—标准的峰面积；

C—标准溶液的浓度，mg/L；

V—样品稀释体积，mL；

M—样品称取量，g。
 

1  叶黄素的测定

1.1  总类胡萝卜素的含量

1.1.1  溶剂：正己烷-丙酮-甲苯-无水乙醇=10:7:7:6

1.1.2  供试品储备液：取样品20粒，剪开囊皮，挤出内容物于干净、干燥小烧杯中，同时将囊皮剖开，将附着于囊皮内表面的内容物刮下，合并于小烧杯中，混合均匀。称取适量样品内容物（含叶黄素约30mg），精密称定，置于100mL容量瓶中，加溶剂振荡溶解，并稀释到刻度。

1.1.3  供试品溶液：精密移取供试品储备液1mL，置于100mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，使其浓度约为3μg/mL。

1.1.4  测定：以无水乙醇为空白，于446nm波长处测定供试品溶液吸光度值。

1.1.5  结果计算

T = 10000A/2550W

式中：

T—样品中总类胡萝卜素含量，g/100g；

A—供试品溶液的吸光度值；

W—样品称取量，g；

2550—叶黄素的吸光系数。

1.2  叶黄素的含量

1.2.1  溶剂：正己烷-丙酮-甲苯-无水乙醇=10:7:7:6

1.2.2  色谱条件

1.2.2.1  色谱柱：4.6mm×250mm×5μm的硅胶柱

1.2.2.2  流动相：正己烷-乙酸乙酯=75:25

1.2.2.3  检测波长：446nm

1.2.2.4  流速：1.0mL/min

1.2.3  对照品溶液：取叶黄素对照品适量，加流动相稀释使其浓度约为150μg/mL。

1.2.4  供试品溶液：吸取1.1.2项供试品储备液1mL，氮气吹干，加1mL正己烷-乙酸乙酯（75:25），超声溶解。

1.2.5  系统适应性：取对照品溶液，连续进样5次，其峰面积响应值的相对标准偏差应不大于2.0%。

1.2.6  测定：吸取供试品溶液10μL，注入色谱仪中，记录色谱图。

1.2.7  结果计算

X = T(R_i/R_s)

式中：

X—样品中叶黄素的含量，g/100g；

T—总类胡萝卜素的含量，g/100g；

R_i—供试品溶液中叶黄素的峰面积；

R_s—供试品溶液中所有组分峰面积之和。