1  粗多糖的测定

1.1  试剂

    除特殊注明外，本方法所用试剂均为分析纯；所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。

1.1.1  乙醇溶液(800mL/L)：20mL水中加入无水乙醇80mL，混匀。

1.1.2  氢氧化钠溶液(100g/L)：称取100g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L，加入固体无水硫酸钠至饱和，备用。

1.1.3  铜储备液：称取3.0g CuSO4·5H2O、30.0g柠檬酸钠，加入溶解并稀释至1L，混匀，备用。

1.1.4  铜试剂溶液：取铜储备液50mL，加水50mL，混匀后加入固体无水硫酸钠12.5g并使其溶解。临用新配。

1.1.5  洗涤剂：取水50mL，加入10mL氢氧化钠溶液，混匀。

1.1.6  硫酸溶液(100mL/L)：取100mL浓硫酸加入到800mL左右水中，混匀，冷却后稀释至1L。

1.1.7  苯酚溶液(50g/L)：称取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀释至100mL，混匀。溶液置于冰箱中可保存一个月。

1.1.8  葡聚糖标准储备液：精密称取分子量500000、干燥至恒重的葡聚糖标准品，用水溶解并定容至50mL，混匀，置于冰箱中保存。此溶液1mL含葡聚糖10.0mg。

1.1.9  葡聚糖标准使用液：吸取葡聚糖标准储备液1.00mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，置于冰箱中保存。此溶液1mL含葡聚糖0.10mg。

1.2  仪器

1.2.1  分光光度计

1.2.2  离心机

1.2.3  旋转混匀器

1.3  标准曲线制备：精密吸取葡聚糖标准使用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL(相当于葡聚糖0、0.010、0.020、0.040、0.060、0.080、0.10mg)，分别置于25mL比色管中，准确补充水至2.0mL，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，于旋转混匀器上小心混匀，置于沸水浴中煮沸2min，冷却后用分光光度计在485nm波长处，以试剂空白溶液为参比，1cm比色杯测定吸光度值。以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.4  样品处理

1.4.1  样品提取：准确取样品2.0g，置于100mL容量瓶中，加水80mL，于沸水浴上加热2h，冷却至室温后加水至刻度，混匀，过滤，弃去初滤液，收集续滤液供沉淀粗多糖。

1.4.2  沉淀粗多糖：精密取1.4.1项下续滤液5.0mL，置于50mL离心管中，加入无水乙醇20mL，混匀后以3000r/min离心5min，充去上清液。残渣用800mL/L乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃上清液，反复操作3～4次。残渣用水溶解并定容至5.0mL，混匀后供沉淀葡聚糖。

1.4.3  沉淀葡聚糖：精密取1.4.2项下终溶液2mL,置于20mL离心管中，加入100g/L氢氧化钠溶液2.0mL、铜试剂溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷却后以3000r/min离心5min，弃去上清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃上清液，反复操作3次后，残渣用100mL硫酸溶液2.0mL溶解并转移至50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液为样品测定液。

1.5  样品测定：精密吸取样品测定液2.0mL，置于25mL比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀后，小心加入浓硫酸10.0mL，于旋转混匀器上小心混匀，置于沸水浴中煮沸2min，冷却至室温后用分光光度计在485nm波长处，以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。从标准曲线上查出葡聚糖质量，计算样品粗多糖含量。同时作样品空白试验。

1.6  结果计算

                          W₁-W₂

            X = —————————————

                  M×V2/V1×V4/V3×V6/V5

    式中：

X—样品中粗多糖含量(以葡聚糖计)，mg/g；

M—样品称取量，g；

W1—样品测定液中葡聚糖的质量，mg；

W2—样品空白溶液中葡聚糖质量，mg；

V1—样品提取液总体积，mL；

V2—沉淀粗多糖所用样品提取液体积，mL；

V3—粗多糖溶液体积，mL；

V4—沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液体积，mL；

V5—样品测定液总体积，mL；

V6—测定用样品测定液体积，mL。