1  二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸的测定

1.1  原理：油脂经皂化处理后生成游离脂肪酸，其中长碳链不饱和脂肪酸经甲酯化后挥发性提高。可以用色谱柱有效分离，用氢火焰离子化检测器检测，使用外标法定量。

1.2  试剂

1.2.1  正己烷：分析纯，重蒸。

1.2.2  甲醇：优级纯

1.2.3  2mol/L氢氧化钠-甲醇溶液：称取8g氢氧化钠溶于100mL甲醇中。

1.2.4  2mol/L盐酸-甲醇溶液：把浓硫酸小心滴加在约100g的氯化钠上，把产生的氯化氢气体通入事先量取的约470mL甲醇中，按质量增加量换算，调制成2mol/L盐酸-甲醇溶液，密闭保存在冰箱内。

1.2.5  二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、二十二碳五烯酸（DPA）标准溶液：精密称取EPA、DHA、DPA各50.0mg，加入正己烷溶解并定容至100mL，此溶液每毫升含EPA 0.50mg、DHA 0.50mg和DPA 0.50mg。

1.3  仪器

1.3.1  气相色谱仪：附氢火焰离子化检测器（FID）

1.3.2  氯化氢发生系统（启普发生器）

1.3.3  刻度试管（带分刻度）：10mL

1.3.4  旋涡式震荡混合器

1.3.5  旋转蒸发仪

1.4  气相色谱条件

1.4.1  色谱柱：玻璃柱1m×4mm（id），填充涂有10%DEGS/Chromosorb W DMCS 80～100目的担体。

1.4.2  气体及气体流速：氮气50mL/min，氢气70mL/min，空气100mL/min。

1.4.3  温度：色谱柱185℃，进样口210℃，检测器210℃。

1.5  皂化：取样品内容物1g于50mL具塞容量瓶中，加入10mL正己烷轻摇使油脂溶解，并用正己烷定容至刻度。吸取此溶液1.00～5.00mL于另一10mL具塞比色管中，再加入2mol/L氢氧化钠-甲醇溶液1mL，充分振荡10min后放入60℃的水浴中加热1～2min，皂化完成后，冷却到室温，待甲酯化用。

1.6  甲酯化

1.6.1  标准溶液系列：准确吸取1.2.5项标准溶液1.0、2.0、5.0mL，分别移入10mL具塞比色管中，再加2mol/L盐酸-甲醇溶液2mL，充分振荡10min，并于50℃水浴中加热2min，进行甲酯化，弃去下层液体，再加约2mL蒸馏水洗净并去除水层，用滴管吸出正己烷层，移至另一装有无水硫酸钠的漏斗中脱水，将脱水后的溶液在70℃水浴上加热浓缩，定容至1mL，待上机测试用。此标准系列中EPA、DHA、DPA的浓度依次为0.5、1.0、2.5mg/mL。

1.6.2  样品溶液：在经1.5项皂化处理后的样品溶液中加入2mol/L盐酸-甲醇溶液2mL，以下按1.6.1项标准溶液系列中“充分振荡10min……”起操作。

1.7  标准曲线的制备：分别吸取经甲酯化处理后的标准溶液1.0μL，注入气相色谱仪中，可测得不同浓度EPA甲酯、DHA甲酯和DPA甲酯的峰高，以浓度为横坐标，相应的峰高响应值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.8  测定：把经1.6项处理后的样品溶液1.0～5.0μL注入气相色谱仪中，以保留时间定性，以测得的峰高响应值与标准曲线比较定量。

1.9  结果计算

A×V₃×V₁×100

X = —————————

m×V₂×1000

式中：

X—样品中二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸的含量，g/100g；

A—被测定样液中二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸的含量，mg/mL；

V₁—样品皂化前定容总体积，mL；

V₂—样品用于皂化样液体积，mL；

V₃—样液最终定容体积，mL；

m—样品质量，g。